PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ହସ୍ତକ୍ଷେପ କାରକ

ପିସିଆର୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସମୟରେ, କିଛି ବାଧା ସୃଷ୍ଟିକାରୀ କାରଣ ପ୍ରାୟତଃ ସାମ୍ନାକୁ ଆସିଥାଏ।
PCRର ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଉଚ୍ଚ ଥିବାରୁ, ପ୍ରଦୂଷଣକୁ PCR ଫଳାଫଳକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରୁଥିବା ସବୁଠାରୁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କାରଣ ମଧ୍ୟରୁ ଗୋଟିଏ ଭାବରେ ବିବେଚନା କରାଯାଏ ଏବଂ ଏହା ମିଥ୍ୟା ସକାରାତ୍ମକ ଫଳାଫଳ ସୃଷ୍ଟି କରିପାରେ।
ସମାନ ଭାବରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ହେଉଛି ବିଭିନ୍ନ ଉତ୍ସ ଯାହା ମିଥ୍ୟା-ନକାରାତ୍ମକ ଫଳାଫଳକୁ ନେଇଥାଏ। ଯଦି PCR ମିଶ୍ରଣର ଗୋଟିଏ କିମ୍ବା ଅଧିକ ଅତ୍ୟାବଶ୍ୟକ ଅଂଶ କିମ୍ବା ଆମ୍ପ୍ଲିଫିକେସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ନିଜେ ବାଧାପ୍ରାପ୍ତ ହୁଏ କିମ୍ବା ଏଥିରେ ବାଧାପ୍ରାପ୍ତ ହୁଏ, ତେବେ ରୋଗ ନିର୍ଣ୍ଣୟ ପରୀକ୍ଷା ବାଧାପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇପାରେ। ଏହା ଦକ୍ଷତା ହ୍ରାସ କରିପାରେ ଏବଂ ମିଥ୍ୟା ନକାରାତ୍ମକ ଫଳାଫଳ ମଧ୍ୟ ଆଣିପାରେ।
ବାଧା ବ୍ୟତୀତ, ନମୁନା ପ୍ରସ୍ତୁତି ପୂର୍ବରୁ ପରିବହନ ଏବଂ/କିମ୍ବା ସଂରକ୍ଷଣ ପରିସ୍ଥିତି ଯୋଗୁଁ ଲକ୍ଷ୍ୟ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡ୍ ଅଖଣ୍ଡତାର କ୍ଷତି ହୋଇପାରେ। ବିଶେଷକରି, ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା କିମ୍ବା ଅପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ସଂରକ୍ଷଣ କୋଷ ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡ୍ କ୍ଷତିର କାରଣ ହୋଇପାରେ। କୋଷ ଏବଂ ଟିସୁ ସ୍ଥିରୀକରଣ ଏବଂ ପାରାଫିନ୍ ଏମ୍ବେଡିଂ ହେଉଛି ଡିଏନଏ ଖଣ୍ଡନ ଏବଂ ଏକ ସ୍ଥାୟୀ ସମସ୍ୟାର ଜଣାଶୁଣା କାରଣ (ଚିତ୍ର 1 ଏବଂ 2 ଦେଖନ୍ତୁ)। ଏହି ପରିସ୍ଥିତିରେ, ସର୍ବୋତ୍ତମ ପୃଥକୀକରଣ ଏବଂ ପରିଷ୍କାରକରଣ ମଧ୍ୟ ସାହାଯ୍ୟ କରିବ ନାହିଁ।

ଚିତ୍ର ୧ | ଡିଏନଏ ଅଖଣ୍ଡତା ଉପରେ ଅଚଳତାର ପ୍ରଭାବ
ଆଗାରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦେଖାଇଲା ଯେ ଶବ ବ୍ୟବଚ୍ଛେଦର ପାରାଫିନ୍ ବିଭାଗରୁ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିବା DNAର ଗୁଣବତ୍ତା ଯଥେଷ୍ଟ ଭିନ୍ନ ଥିଲା। ସ୍ଥିରୀକରଣ ପଦ୍ଧତି ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି ନିର୍ଗମରେ ବିଭିନ୍ନ ହାରାହାରି ଖଣ୍ଡ ଲମ୍ବ ଥିବା DNA ଉପସ୍ଥିତ ଥିଲା। ଦେଶୀୟ ଫ୍ରିଜନ୍ ନମୁନା ଏବଂ ବଫର୍ ହୋଇଥିବା ନିରପେକ୍ଷ ଫର୍ମାଲିନ୍ ରେ ସ୍ଥିର ହେବା ପରେ DNA କେବଳ ସଂରକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା। ଏକ ଦୃଢ଼ ଏସିଡିକ୍ ବୋଇନ୍ ଫିକ୍ସେଟିଭ୍ କିମ୍ବା ଅନବଫର୍ ହୋଇଥିବା, ଫର୍ମିକ ଏସିଡ୍-ଯୁକ୍ତ ଫର୍ମାଲିନ୍ ବ୍ୟବହାର ଫଳରେ DNAର ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କ୍ଷତି ହୋଇଥିଲା। ଅବଶିଷ୍ଟ ଅଂଶ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଖଣ୍ଡିତ।
ବାମ ପାର୍ଶ୍ୱରେ, ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକର ଦୈର୍ଘ୍ୟ କିଲୋବେସ୍ ଯୋଡ଼ା (kbp) ରେ ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଛି।

ଚିତ୍ର 2 | ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡ୍ ଲକ୍ଷ୍ୟସ୍ଥଳର ଅଖଣ୍ଡତା ହ୍ରାସ
(କ) ଉଭୟ ଷ୍ଟ୍ରେଣ୍ଡରେ 3′-5′ ବ୍ୟବଧାନ ଲକ୍ଷ୍ୟ DNA ରେ ଏକ ଭାଙ୍ଗିଯିବ। DNA ର ସଂଶ୍ଳେଷଣ ତଥାପି ଛୋଟ ଖଣ୍ଡରେ ଘଟିବ। ତଥାପି, ଯଦି DNA ଖଣ୍ଡରେ ଏକ ପ୍ରାଇମର ଆନିଲିଂ ସ୍ଥାନ ଅନୁପସ୍ଥିତ ଥାଏ, ତେବେ କେବଳ ରେଖୀୟ ପ୍ରଶସ୍ତିକରଣ ହୁଏ। ସବୁଠାରୁ ଅନୁକୂଳ କ୍ଷେତ୍ରରେ, ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ପରସ୍ପରକୁ ପୁନଃସଂତୃପ୍ତ କରିପାରନ୍ତି, କିନ୍ତୁ ଉତ୍ପାଦନ ଛୋଟ ଏବଂ ଚିହ୍ନଟ ସ୍ତର ତଳେ ହେବ।
(ଖ) ମୁଖ୍ୟତଃ ଡିପ୍ୟୁରିନେସନ୍ ଏବଂ ଥାଇମିଡିନ୍ ଡାଇମର ଗଠନ ହେତୁ ଆଧାର ହ୍ରାସ ହେବା ଫଳରେ H-ବଣ୍ଡ ସଂଖ୍ୟା ହ୍ରାସ ପାଏ ଏବଂ Tm ହ୍ରାସ ପାଏ। ଲମ୍ବା ଉଷ୍ଣତା ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ, ପ୍ରାଇମରଗୁଡ଼ିକ ମାଟ୍ରିକ୍ସ DNA ରୁ ତରଳିଯିବେ ଏବଂ କମ୍ କଠୋର ପରିସ୍ଥିତିରେ ମଧ୍ୟ ଆନିଲ୍ ହେବ ନାହିଁ।
(ଗ) ପାର୍ଶ୍ୱବର୍ତ୍ତୀ ଥାଇମିନ୍ କ୍ଷାଳ ଏକ TT ଡାଇମର ଗଠନ କରେ।
ଆଣବିକ ନିଦାନରେ ପ୍ରାୟତଃ ଦେଖାଯାଉଥିବା ଅନ୍ୟ ଏକ ସାଧାରଣ ସମସ୍ୟା ହେଉଛି ଫେନୋଲ-କ୍ଲୋରୋଫର୍ମ ନିଷ୍କାସନ ତୁଳନାରେ ଲକ୍ଷ୍ୟ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡର କମ୍ ମୁକ୍ତାୟନ। ଚରମ ପରିସ୍ଥିତିରେ, ଏହା ମିଥ୍ୟା ନକାରାତ୍ମକ ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇପାରେ। କୋଷ ଅବଶେଷର ଫୁଟାଇବା ଲାଇସିସ୍ କିମ୍ବା ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ପାଚନ ଦ୍ୱାରା ବହୁତ ସମୟ ସଞ୍ଚୟ କରାଯାଇପାରିବ, କିନ୍ତୁ ଏହି ପଦ୍ଧତି ପ୍ରାୟତଃ ଅପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡ୍ ମୁକ୍ତା ଯୋଗୁଁ କମ୍ PCR ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ସୃଷ୍ଟି କରେ।

ପ୍ରଶସ୍ତିକରଣ ସମୟରେ ପଲିମରେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ନିରୋଧ

ସାଧାରଣତଃ, ସବଅପ୍ଟିମଲ୍ PCR ଫଳାଫଳ ଆଡ଼କୁ ନେଇଯାଉଥିବା ସମସ୍ତ କାରକଗୁଡ଼ିକୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରିବା ପାଇଁ ନିରୋଧକୁ ଏକ ଧାରକ ଧାରଣା ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। ଏକ କଠିନ ଜୈବରାସାୟନିକ ଅର୍ଥରେ, ନିରୋଧ ଏନଜାଇମର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସୀମିତ, ଅର୍ଥାତ୍, ଏହା DNA ପଲିମରେଜ୍ କିମ୍ବା ଏହାର ସହକାରକ (ଯଥା, Taq DNA ପଲିମରେଜ୍ ପାଇଁ Mg2+) ର ସକ୍ରିୟ ସ୍ଥାନ ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ମାଧ୍ୟମରେ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍-ଉତ୍ପାଦ ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ହ୍ରାସ କରେ କିମ୍ବା ରୋକିଥାଏ।
ନମୁନାରେ ଥିବା ଉପାଦାନ କିମ୍ବା ବିଭିନ୍ନ ବଫର ଏବଂ ରିଏଜେଣ୍ଟ ଥିବା ନିର୍ଗମ ସିଧାସଳଖ ଏନଜାଇମକୁ ବାଧା ଦେଇପାରେ କିମ୍ବା ଏହାର ସହକାରକଗୁଡ଼ିକୁ (ଯେପରିକି EDTA) ଫସାଇପାରେ, ଯାହା ଦ୍ଵାରା ପଲିମରେଜକୁ ନିଷ୍କ୍ରିୟ କରିପାରେ ଏବଂ ଫଳସ୍ୱରୂପ ହ୍ରାସ କିମ୍ବା ମିଥ୍ୟା ନକାରାତ୍ମକ PCR ଫଳାଫଳ ଆଣିପାରେ।
ତଥାପି, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଉପାଦାନ ଏବଂ ଲକ୍ଷ୍ୟ-ଧାରଣ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡ୍ ମଧ୍ୟରେ ଅନେକ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟାକୁ 'PCR ଇନହିବିଟର' ଭାବରେ ମଧ୍ୟ ନାମିତ କରାଯାଇଛି। ଥରେ କୋଷର ଅଖଣ୍ଡତା ପୃଥକୀକରଣ ଦ୍ୱାରା ବାଧାପ୍ରାପ୍ତ ହୁଏ ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡ୍ ମୁକ୍ତ ହୁଏ, ନମୁନା ଏବଂ ଏହାର ପାରିପାର୍ଶ୍ୱିକ ଦ୍ରବଣ ଏବଂ କଠିନ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଘଟିପାରେ। ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, 'ସ୍କାଭେଞ୍ଜର' ଅଣ-ସହଯୋଗୀ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ମାଧ୍ୟମରେ ଏକକ କିମ୍ବା ଦ୍ୱିଗୁଣିତ DNA କୁ ବାନ୍ଧି ପାରନ୍ତି ଏବଂ ଶେଷରେ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାତ୍ରରେ ପହଞ୍ଚିଥିବା ଲକ୍ଷ୍ୟ ସଂଖ୍ୟାକୁ ହ୍ରାସ କରି ପୃଥକୀକରଣ ଏବଂ ପରିଷ୍କାରକରଣରେ ବାଧା ସୃଷ୍ଟି କରନ୍ତି।
ସାଧାରଣତଃ, PCR ଇନହିବିଟରଗୁଡ଼ିକ ଅଧିକାଂଶ ଶରୀର ତରଳ ଏବଂ କ୍ଲିନିକାଲ୍ ଡାଇଗ୍ନୋଷ୍ଟିକ୍ ପରୀକ୍ଷା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ରିଏଜେଣ୍ଟ (ପରିସ୍ରାରେ ୟୁରିଆ, ରକ୍ତରେ ହିମୋଗ୍ଲୋବିନ୍ ଏବଂ ହେପାରିନ୍), ଖାଦ୍ୟ ପରିପୂରକ (ଜୈବ ଉପାଦାନ, ଗ୍ଲାଇକୋଜେନ୍, ଚର୍ବି, Ca2+ ଆୟନ୍) ଏବଂ ପରିବେଶରେ ଥିବା ଉପାଦାନ (ଫିନୋଲ୍, ଭାରୀ ଧାତୁ) ରେ ଉପସ୍ଥିତ ଥାଏ।

ଅଧିକ ପ୍ରଚଳିତ PCR ଇନହିବିଟରଗୁଡ଼ିକ ଜୀବାଣୁ ଏବଂ ୟୁକାରିଓଟିକ୍ କୋଷ, ଅଣ-ଲକ୍ଷ୍ୟ DNA, ଟିସୁ ମାଟ୍ରିକ୍ସର DNA-ବନ୍ଧନକାରୀ ମାକ୍ରୋମଲିକ୍ୟୁଲ୍ସ ଏବଂ ଗ୍ଲୋଭସ୍ ଏବଂ ପ୍ଲାଷ୍ଟିକ୍ ପରି ପରୀକ୍ଷାଗାର ଉପକରଣରେ ମିଳିପାରିବ। PCR ଇନହିବିଟରଗୁଡ଼ିକୁ ଅପସାରଣ କରିବା ପାଇଁ ନିଷ୍କାସନ ସମୟରେ କିମ୍ବା ପରେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡର ବିଶୋଧନ ହେଉଛି ପସନ୍ଦିତ ପଦ୍ଧତି।
ଆଜି, ବିଭିନ୍ନ ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ନିଷ୍କାସନ ଉପକରଣ ଅନେକ ମାନୁଆଲ୍ ପ୍ରୋଟୋକଲକୁ ବଦଳାଇପାରେ, କିନ୍ତୁ ଲକ୍ଷ୍ୟର 100% ପୁନରୁଦ୍ଧାର ଏବଂ/କିମ୍ବା ପରିଷ୍କାରକରଣ କେବେବି ହାସଲ କରାଯାଇନାହିଁ। ସମ୍ଭାବ୍ୟ ନିଷେଧକମାନେ ଏବେ ବି ପରିଷ୍କୃତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡରେ ଉପସ୍ଥିତ ଥାଇପାରନ୍ତି କିମ୍ବା ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରଭାବ ପକାଇସାରିଛନ୍ତି। ନିଷେଧକର ପ୍ରଭାବକୁ ହ୍ରାସ କରିବା ପାଇଁ ବିଭିନ୍ନ ରଣନୀତି ରହିଛି। ଉପଯୁକ୍ତ ପଲିମରେଜ୍ ଚୟନ ନିଷେଧକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଉପରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରଭାବ ପକାଇପାରେ। PCR ନିଷେଧକୁ ହ୍ରାସ କରିବା ପାଇଁ ଅନ୍ୟ ପ୍ରମାଣିତ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ ହେଉଛି ପଲିମରେଜ୍ ସାନ୍ଦ୍ରତା ବୃଦ୍ଧି କରିବା କିମ୍ବା BSA ପରି ଯୋଗକ ପ୍ରୟୋଗ କରିବା।
ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଗୁଣବତ୍ତା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ (IPC) ବ୍ୟବହାର ଦ୍ୱାରା PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ପ୍ରତିରୋଧ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରାଯାଇପାରିବ।
ନିଷ୍କାସନ କିଟ୍‌ରେ ଥିବା ସମସ୍ତ ରିଏଜେଣ୍ଟ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ଦ୍ରବଣ, ଯେପରିକି ଇଥାନଲ୍, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ଆଇସୋପ୍ରୋପାନୋଲ୍ ଏବଂ ଫିନୋଲ୍, କୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଧୋଇବା ପଦକ୍ଷେପ ଦ୍ୱାରା ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଏସିଡ୍ ଆଇସୋଲେଟ୍ ରୁ ବାହାର କରିବା ପାଇଁ ସତର୍କତା ଅବଲମ୍ବନ କରିବାକୁ ପଡିବ। ସେମାନଙ୍କର ସାନ୍ଦ୍ରତା ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି, ସେମାନେ PCRକୁ ସକ୍ରିୟ କିମ୍ବା ବାଧା ଦେଇପାରନ୍ତି।